การหาลำดับเบสด้านข้าง LB ของ T-DNA ที่สอดแทรกในจีโนมกล้วยไม้สกุลหวายพันธุ์ เอียสกุล ดัดแปลงพันธุกรรมด้วยเทคนิค AL-PCR
DOI:
https://doi.org/10.14456/thaidoa-agres.2021.11คำสำคัญ:
พืชดัดแปลงพันธุกรรม, เทคนิค AL-PCR, ตำแหน่งสอดแทรกของยีนเป้าหมายบทคัดย่อ
การถ่ายยีนในพืชโดยใช้แบคทีเรีย Agrobacterium tumefaciens เป็นพาหะนั้น T-DNA ที่ถูกส่งถ่ายเข้าสู่เซลล์พืชนั้นจะแทรกเข้าไปในจีโนมพืชแบบสุ่ม ซึ่งตำแหน่งที่มีการสอดแทรกนี้ อาจมีผลกระทบต่อการแสดงออกของยีนและลักษณะทางสรีระได้ ในการศึกษาครั้งนี้ได้ทำการตรวจสอบลำดับเบสที่อยู่ด้านข้างของปลายด้าน LB ของ T-DNA ที่สอดแทรกอยู่ในจีโนมกล้วยไม้สกุลหวายพันธุ์เอียสกุล ที่ได้รับการถ่ายยีน antisense CP-ACO1 ด้วยเทคนิค Adaptor Ligation-Polymerase Chain Reaction (AL-PCR) ซึ่งทำโดยการย่อยจีโนมิคดีเอ็นเอของกล้วยไม้ดัดแปลงพันธุกรรม ด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ PsiI ที่มีจุดตัดอยู่ภายในยีนที่ถ่ายเข้าไป และให้ผลผลิตชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีลักษณะปลายทู่ (blunt end) จากนั้น นำมาเชื่อมต่อกับส่วนปลายของ adaptor ซึ่งมีลักษณะปลายทู่ เช่นเดียวกัน แล้วนำมาทำปฏิกิริยา PCR โดยใช้ forward primer ที่มีลำดับเบส คู่สมกับ adapter ส่วนของ reverse primer นั้น ออกแบบให้มีลำดับเบสที่จำเพาะกับ ยีน hpt ที่ถูกถ่ายเข้าไปในพืช ผลจากการวิเคราะห์ผลผลิตของ AL-PCR พบว่า ได้แถบดีเอ็นเอจำนวน 3 แถบ ขนาดประมาณ 750 1,500 และ 2,000 คู่เบส ซึ่งเมื่อวิเคราะห์ลำดับเบสของแถบดีเอ็นเอที่มีความยาว 750 คู่เบส พบว่า ประกอบด้วยลำดับเบสในส่วนของยีน hpt และ LB ของ T-DNA ความยาว 554 คู่เบส ที่เชื่อมต่อกับลำดับเบสของพลาสมิด (vector backbone) ที่ถัดออกไปจาก LB จำนวน 160 คู่เบส สำหรับแถบดีเอ็นเอที่มีขนาด 1,500 และคู่เบส 2,000 นั้นไม่สามารถวิเคราะห์ลำดับเบสได้ เนื่องจากมีความบริสุทธิ์และปริมาณไม่เพียงพอ
เอกสารอ้างอิง
ปิยนุช ศรชัย. 2558. การตรวจสอบความปลอดภัยทางชีวภาพของกล้วยไม้สกุลหวายที่ได้รับการถ่ายยีน antisense CP-ACO1 ในระดับโรงเรือน. วิทยานิพนธ์ปริญญาเอก, มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์.
Abdal-Aziz, S.A., F. Pliego-Alfaro, M.A. Quesada and J.A. Mercado. 2006. Evidence of frequent integration of non-T-DNA vector backbone sequences in transgenic strawberry plants. J. Biosci. Bioeng. 101(6); 508-510.
Afolabi, A.S., B. Worland, J.W. Snape and P. Vain. 2004. A large-scale study of rice plants transformed with different T-DNAs provides new insights into locus composition and T-DNA linkage configurations. Theoretical and Applied Genetics. 109: 815–826.
Choi, Y.I, E.W. Noh, M.S. Han and S.H. Son. 1999. Adaptor-aided PCR to identify T-DNA junctions in transgenic plants. BioTechniques. 27: 222-226.
Cullen, D., W. Harwood, M. Smedley, H. Davies and M. Taylor. 2011. Comparison of DNA Walking Methods for Isolation of Transgene-Flanking Regions in GM Potato. Mol Biotechnol. 49(1):19-31.
De Buck, S.D., C.D. Wilde, M.V. Montagu and A. Depicker. 2000. T-DNA vector backbone sequences are frequently integrated into the genome of transgenic plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation. Molecular Breeding. 6: 459-468.
Fu, D., P.C.St. Amand, Y. Xiao, S. Muthukrishnan and G.H. Liang. 2006. Characterization of T-DNA integration in creeping bentgrass. Plant Science. 170: 225–237.
Kohli, A., B. Miro and R.M. Twyman. 2010. Transgene integration, expression and stability in plants: strategies for improvements. Transgenic Crop Plants. 201-237.
Kononov, M.E., B. Bassuner and S.B. Gelvin. 1997. Integration of T-DNA binary vector ‘backbone’ sequences into the tobacco genome: evidence for multiple complex patterns of integration. The Plant J. 11(5): 945-957.
Kuraya, Y., S. Ohta and M. Fukude. 2004. Suppression of transfer of non-T-DNA ‘vector backbone’ sequences by multiple left border repeat in vector for transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens. Mol Breed. 14:309-320.
Malley, R.C.O., J.S. Alonso, C.J. Kim, T.J. Leisse and J.R. Ecker. 2007. An adapter ligation-mediated PCR method for high throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome. NATURE PROTOCOL. 2(11): 2910-2917.
Meza, T.J., B. Stangeland, I.S. Mercy, M. Skarn, D.A. Nymoen, A. Berg, M.A. Butenko, A.M. Hakelian, C. Haslekas, L.A. Meza-Zepeda and R.B. Aalen. 2002. Analyses of single-copy Arabidopsis T-DNA-transformed lines show that the presence of vector backbone sequences, short inverted repeats and DNA methylation is not sufficient or necessary for the induction of transgene silencing. Nucleic Acids Res. 30(20): 4556-4566.
Nicolia, A., N. Ferradini, F. Veronesi and D. Rosellini. 2017. An insight into T-DNA integration
events in Medicago sativa. Int. J. Mol. Sci. 18: 1951-1966.
Okwuonu, I.C., C.N. Egesi and N.J. Taylor. 2019. Vector backbone integration in transgenic cassava is significantly correlated to T-DNA copy number. Nig. J. Biotech. 36(2): 77-86.
Oltmanns, H., B. Frame, L.Y. Lee, S. Johnson, B. Li, K. Wang and S.B. Gelvin. 2010. Generation of Backbone-free, Low transgene copy plants by launching T-DNA from the Agrobacterium chromosome. Plant Physiol. 152: 1158-1166.
Padegimas, L.S. and N.A. Reichert. 1998. Adaptor ligation-based polymerase chain reaction mediated walking. Anal Biochem. 260: 149-153.
Petti, C., T. Wendt, C. Meade and E. Mullins. 2009. Evidence of genotype dependency within Agrobacterium tumefaciens in relation to the integration of vector backbone sequence in transgenic Phytophthora infestans-tolerant potato. J. Biosci. Bioeng. 107(3): 301-306.
Sha, Y., S. Li, Z. Pei, L. Luo, Y. Tian and C. He. 2004. Generation and flanking sequence analysis of rice T-DNA tagged population. Theoretical and Applied Genetics, 108: 306-314.
Sornchai, P., R. Koto, P. Burns, S. Chanprame, W. Imsabai and S. Chanprame. 2015. Genetic transformation of Dendrobium ‘Sonia Earsakul’ with antisense Carica papaya ACO1 gene. Mod. Appl. Sci. 9(12): 125-133.
Sornchai, P., W.G. vanDoorn, W. Imsabai, P. Burns and S. Chanprame. 2020. Dendrobium orchids carrying antisense ACC oxidase: Small changes in flower morphology and a delay of bud abortion, flower senescence, and abscission of flowers. Transgenic Res. 29.429-442.
Spertini, D., C. Beliveau and G. Bellemare. 1999. Screening of transgenic plants by amplification of unknown genomic DNA flanking T-DNA. Biotechniques. 27: 308-314.
Yang, X., F. Li, X. Zhang, K. Liu, Q. Wang, C. Zhang, C. Liu, W. Zhu, G. Shan, C.K. Chin and W. Fang. 2013. Integration and characterization of T-DNA insertion in Upland Cotton. Czech j. Genet. Plant Breed. 49(2): 51-57.
Zeng, F., Y. Zhan, H. Zhao, Y. Xin, H. Qi and C. Yang. 2010. Molecular characterization of T-DNA integration sites in transgenic birch. Trees. 24: 753–762.
Zhang, J., C. Lin, J.Q. Cheng, H.Z. Mao, X.P. Fan, Z.H. Meng, K.M. Chan, H.J. Zhang, J.F. Qi, L.H. Ji and Y. Hong. 2008. Transgene integration and organization in cotton (Gossypium hirsutum L.) genome. Transgenic Res. 17: 293-306.
Zheng, S.J., B. Henken, Sofiari, E. Jacobsen, F.A. Krens and C. Kik. 2001. Molecular characterization of transgenic shallots (Allium cepa L.) by adaptor ligation PCR (AL-PCR) and sequencing of genomic DNA flanking T-DNA borders. Transgenic Res. 10: 237–245.
Ziemienowicz, A., T. Tzvi and B. Hohn. 2008. Mechanisms of T-DNA integration. p.395-440. In: Agrobacterium: From Biology to Biotechnology; Tzvi Tzfira and Vitaly Citrovsky, Ed.; Springer New York p.395-440.
ดาวน์โหลด
เผยแพร่แล้ว
รูปแบบการอ้างอิง
ฉบับ
ประเภทบทความ
สัญญาอนุญาต
ลิขสิทธิ์ (c) 2021 วารสารวิชาการเกษตร
อนุญาตภายใต้เงื่อนไข Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
วารสารวิชาการเกษตร
