การโคลนและวิเคราะห์ยีนไซโคลฟิลินจากข้าวฟ่างและการถ่ายยีนเข้าสู่ยาสูบ

บทคัดย่อ

การโคลนยีนไซโคลฟิลิน (cyclophilin : CyP) ซึ่งเป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างระบบ ภูมิคุ้มกัน และยับยั้งขบวนการที่ก่อให้เกิดความ เสียหายแก่พืช ซึ่งช่วยให้พืชดำรงชีวิตอยู่ได้ใน สภาวะที่ไม่เหมาะสม ดำเนินการวิจัยที่ห้อง ปฏิบัติการ สำนักวิจัยพัฒนาเทคโนโลยีชีวภาพ จ.ปทุมธานี ระหว่างเดือนตุลาคม พ.ศ. 2551 - กันยายน พ.ศ. 2553 งานวิจัยในครั้งนี้ได้ทำการ โคลนยีน CyP จากข้าวฟ่าง ซึ่งเป็นพืชที่มี ลักษณะทนแล้ง โดยทำการออกแบบไพรเมอร์ที่มี ความจำเพาะกับยีน CyP จากฐานข้อมูล NCBI ได้แก่ CyP4 (forward) + CyP4 (reverse) นำ มาทำปฏิกิริยา PCR กับจีโนมิกดีเอ็นเอของข้าว ฟ่าง 2 พันธุ์ ได้แก่ อู่ทอง 1 (UT 1) และ สุพรรณบุรี 60 (SPR 60) ได้ยีนขนาด 1,062 คู่ เบส (genbank accession no EU 722309) เมื่อนำข้อมูลที่ได้มาวิเคราะห์โครงสร้างของยีน โดยใช้โปรแกรม EMBL-EBI database บนอิน เทอร์เน็ต พบว่ายีน CyP ที่ได้มีส่วนประกอบ ครบทั้งยีน ซึ่งประกอบด้วย ลำดับเบสในส่วน ของ open reading frame (ORF) มีขนาด เท่ากับ 519 คู่เบส 5’UTR มีขนาด 130 คู่เบส 3’UTR มีขนาด 143 คู่เบส และพบลำดับนิวคลี โอไทด์ที่เป็น AATAA motif สามารถแปลเป็น รหัสเปปไทด์ได้จำนวน 172 amino acid จาก นั้นทำการโคลนยีนในส่วนที่มีการแสดงออกโดย การทำปฏิกิริยา PCR กับจีโนมิกดีเอ็นเอของข้าว ฟ่างร่วมกับไพรเมอร์ที่มีความจำเพาะกับยีน ได้แก่ CyPXbal (forward) + CyPKpnl (forward) ซึ่งได้เติมลำดับเบสที่เป็นตำแหน่ง จดจำของเอนไซม์ตัดจำเพาะ XbaI และ KpnI เพื่อบังคับทิศทางของการแปลรหัส ได้ยีน CyP ขนาด 519 คู่เบส ทำการเชื่อมต่อยีน CyP เข้า กับ plant expression vector (pCAMBIA2300) ที่ประกอบด้วยโปรโมเตอร์ (35SCaMV) และเทอร์มิเนเตอร์ (NOS) ได้ พลาสมิดสายผสม (pCAMBIA2300 – CyP) ขนาดประมาณ 10 กิโลเบส ถ่ายฝากยีนที่ได้เข้า สู่ใบยาสูบโดยใช้วิธีอะโกรแบคทีเรีย คัดเลือกต้น ที่ได้รับการถ่ายยีนบนอาหารคัดเลือกที่เติมสาร ปฏิชีวนะ kanamycin สามารถคัดเลือกต้นที่ได้ รับการถ่ายยีนจำนวน 25 ต้น นำต้นที่ได้รับการ คัดเลือกมาตรวจสอบการปรากฏของยีนโดยใช้ เทคนิค PCR โดยใช้ไพรเมอร์ 2 คู่ ได้แก่ CyPXbaI (forward) + CyPKpnI (reverse) และ NOS (forward) + 35SCaMV (reverse) พบว่าต้นยาสูบที่ได้รับการถ่ายยีนมีจำนวน ทั้งหมด 10 ต้น