Acetolactate Synthase Gene Mutation Conferring lmazapyr-Resistant Sugarcane Cell Line

Abstract

Selection  of  sugarcane cell   line    resistant   to  imazapyr    was conducted    to investigate    whether   the   biochemical    and    molecular basis   of    resistance   was    acetolactate     synthase  (ALS)   gene    mutation    in    resistant    sugarcane    cells.   The    experiment    was    conducted     at    the    Laboratory    of   Plant    Research    Group,   National  Centre   for    Genetic     Engineering    and     Biotechnology,    Kasetsart    University,    Kamphaeng     Saen     Campus,    Nakhon    Pathom     province. Selection    of    sugarcane     cells    resistant   to   imazapyr    was    carried  out    using    callus    and     cell    suspension    induced    from     the    tight  young    furled   leaves   of   sugarcane    clone   K  97-32.   The    cell    suspension   was     cultured   in   modified    liquid    MS    medium   supplemented     with    coconut    water   10%/L, casein    hydrolysate  0.5 g/l, myo-inositol  0.1 g/l   and  2,4-D 3mg/l.  A   sugarcane   cell   resistant   to  1µM imazapyr was obtained after 378 days of selection, using a stepwise selection with increasing concentraltions of imazapvr from 0.1 to 1µM. Surviving    cells   were   sub-cultured    at   14  days   interval.   This   indicates    that   the    resistant    cells   was   918-fold  more   resistant   to   imazapyr   than    the     normal    cells.  To   establish    the    biochemical    mechanism   of   resistance    to    imazapyr,   ALS   activity   of    the    resistant    cells    was   10.8-fold    higher    than     that   of the    normal    cells.    In   addition,   to   investi-gate   the   molecular    of  ALS gene   at   target    site   responsible   for   the   herbicide    activity,    the    partial     of   ALS   gene    region    covering   455  bp   of   domain  B  and   E from   the    normal    and    resistant    cells   was   amplified    and    sequenced.  The   partial    sequence   of   ALS   gene   of   the   normal    and   resistant    cells    was    deposited   in   the    GenBank    database    with   accession    number   EU 243998   and   EU 243999,  respectively.   The   ALS   gene    sequence    of   the   resistant     cells   showed     the    point     mutant a   form    deletion    of   alanine   (A)   at   666   position,   numbering    based  on    Arabidopsis    thaliana    (GenBank   accession    number X 51514).  This result   suggested    that    the   partial    of   ALS   gene    was   occurred   the point   mutant   a form    deletion     resulting   in    the   alteration    at   target   site,    based   on   the   ALS   activity,   leading   to   less   sensitivity    to  imazapyr.