การพัฒนาเทคนิค ELISA เพื่อวัดปริมาณฮีโมไซยานินในฮีโมลิมฟ์ของกุ้งแชบ๊วย
Abstract
ฮีโมไซยานินเป็นโปรตีนที่มีคอปเปอร์เป็นองค์ประกอบ พบมากในฮีโมลิมฟ์ของมอลลัส และ
อาร์โธรพอด ฮีโมไซยานินถูกพบเป็นสารตั้งต้นของสายเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ต้านเชื้อรา และถูกเปลี่ยนไปเป็นเอนไซม์ฟีนอลออกซิเดสโดยการกระตุ้นด้วยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (Sodium dodecyl sulphate, SDS) เนื่องจากเอนไซม์ฟีนอลออกซิเดสมีบทบาทสำคัญในระบบภูมิคุ้มกันของครัสเตเชียน ดังนั้นฮีโมไซยานินน่าจะมีบทบาทเกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกันด้วย ในงานวิจัยนี้ได้ทำบริสุทธิ์ฮีโมไซยานินจากฮีโมลิมฟ์ของกุ้งแชบ๊วยด้วยวิธีอัลตราเซนตริฟิวจ์และโพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรฟอรีซิส (PAGE) แบบเตรียม ฮีโมไซยานินบริสุทธ์ปรากฏโปรตีน 1 แถบ ใน PAGE แบบไม่แปลงสภาพ และมีหน่วยย่อย 2 ขนาดคือ 75 และ 79.4 kDa ใน SDS-PAGE แอนติบอดีที่ได้สังเคราะห์ต่อฮีโมไซยานินบริสุทธิ์ในกระต่าย พบว่ามีความจำเพาะสูงต่อฮีโมไซยานินในฮีโมลิมฟ์และถูกใช้ในการพัฒนาเทคนิค ELISA ให้มีความไวสูง โดยสามารถวัดฮีโมไซยานินที่มีปริมาณต่ำถึง 10 นาโนกรัมได้ จากการวิเคราะห์โดยวิธี ELISA พบปริมาณฮีโมไซยานินคิดเป็น 85.67% ของโปรตีนทั้งหมดในฮีโมลิมฟ์ของกุ้งแชบ๊วยปกติ และเมื่อฉีดกุ้งด้วยแบคทีเรียก่อโรค พบว่าฮีโมไซยานินในฮีโมลิมฟ์มีปริมาณเพิ่มขึ้นจนมีค่าสูงสุดที่ 12 ชั่วโมง หลังการฉีด บ่งชี้ว่าฮีโมไซยานินถูกกระตุ้นให้มีปริมาณเพิ่มขึ้นและอาจเกี่ยวข้องในระบบภูมิคุ้มกันของกุ้งเพื่อตอบสนองต่อแบคทีเรียก่อโรค
