การปรับแต่งกรรมวิธีของปฏิกิริยาลูกโซ่พอรีมอเรสสหรับการตรวจสอบมะละกอดัดแปลง พันธุกรรมในห้องปฏิบัติการขนาดเล็ก

บทคัดย่อ

จากมาตรการห้ามนำเข้าพืชดัดแปลง พันธุกรรมในหลายประเทศ ผู้ประกอบการส่งออก มะละกอของประเทศไทย มีความจำเป็นต้องตรวจ คัดกรองการปะปนของมะละกอดัดแปลงพันธุกรรม ตั้งแต่แปลงเกษตร การตรวจผลิตผลที่รับซื้อ และตรวจผลิตภัณฑ์ก่อนการส่งออกไปยังประเทศ อื่น ๆ ซึ่งปัจจุบันการตรวจคัดกรองพืชดัดแปลง พันธุกรรมนิยมใช้เทคนิค Real-time PCR ที่เป็น วิธีมาตรฐานระดับสากล แต่มีต้นทุนการตรวจ วิเคราะห์สูงงานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อปรับแต่ง เทคนิค PCR ซึ่งเป็นเทคนิคพื้นฐานให้สามารถ นำมาใช้ตรวจวิเคราะห์การปะปนของมะละกอ ดัดแปลงพันธุกรรม ให้มีประสิทธิภาพเหมาะสม กับห้องปฏิบัติการขนาดเล็ก และมีต้นทุนการตรวจ วิเคราะห์ตำ ่ โดยศึกษาปัจจัยภายในที่เกี่ยวข้องกับ การทำปฏิกิริยาพีซีอาร์เพื่อใช้ในการตรวจสอบยีน 35SCaMV promoter Nos terminator ยีน nptII และยีน papain ได้แก่ ช่วงอุณหภูมิannealing ที่สามารถตรวจพร้อมกัน 3 ยีน ชุดไพรเมอร์ของ แต่ละยีน ความเข้มข้นสุดท้ายของไพรเมอร์ปริมาณ ดีเอ็นเอที่ใช้ และวิธีการสกัดดีเอ็นเอที่เหมาะสม ในการทำปฏิกิริยา PCR และดำเนินการศึกษา ปัจจัยภายนอกได้แก่ เครื่อง PCR โปรแกรมและ จำนวนรอบของการทำปฏิกิริยา PCR ผลการ ศึกษา พบว่า การตรวจคัดกรองยีนดังกล่าวด้วย เทคนิค PCR ต้องประกอบด้วยปัจจัยดังต่อไปนี้ 1) อุณหภูมิannealing ที่เหมาะสมสำหรับการ เพิ่มปริมาณทุก ๆ ยีน คือ 58๐ ซ. 2) ความเข้มข้น สุดท้ายของไพรเมอร์คือ 0.2 ไมโครโมลาร์และ 3) ปริมาณดีเอ็นเอเริ่มต้นที่เหมาะสม คือ50 นาโนกรัม ต่อปฏิกิริยา เป็นต้นไป โดยวิธีการสกัดดีเอ็นเอที่ ไม่เหมาะสมอาจหลงเหลือสารยับยั้งปฏิกิริยา ซึ่ง ส่งผลต่อผลผลิตปฏิกิริยา PCR นอกจากนี้การ ลดระยะเวลาในขั้นตอน Initial Denaturation และ Extension ลงขั้นตอนละ 5 นาทีรวมถึง การลดจำนวนรอบในการทำปฏิกิริยา PCR เป็น จำนวน 10 รอบ สามารถช่วยลดระยะเวลาการ ตรวจวิเคราะห์มะละกอดัดแปลงพันธุกรรมได้ 40 นาทีโดยให้ผลปฏิกิริยาที่มีประสิทธิภาพเทียบเท่า วิธีการวิเคราะห์ด้วยโปรแกรมดั้งเดิม ที่ใช้ระยะ เวลาประมาณ 2 ชม.