การผลิตโพลีโคลนอลแอนติซีรัมจำเพาะต่อโปรตีนห่อหุ้มของไวรัสก่อโรคใบด่างเหลือง ของมะเขือเปราะ

บทคัดย่อ

การผลิตโพลีโคลนอลแอนติซีรัมของ ไวรัสสาเหตุโรคใบด่างของมะเขือเปราะโดยใช้ recombinant protein ที่สังเคราะห์จากโคลน ของยีนโปรตีนห่อหุ้มอนุภาคของเชื้อ Eggplant yellow mosaic virus (EYMV) ที่ได้มาจากการ แยกสกัดดีเอ็นเอแบบพลาสมิดจากใบมะเขือ เปราะที่เป็นโรคใบด่างของมะเขือเปราะ นำไป เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอด้วยไพรเมอร์คู่ที่ออกแบบ จากส่วนของยีนโปรตีนห่อหุ้มอนุภาคของ EYMV คือ EYMV-CPF และ EYMV-CPR สังเคราะห์ ได้ชิ้นของดีเอ็นเอขนาดประมาณ 777 bp นำไป โคลนเข้าสู่เวคเตอร์ pUC57 plasmid DNA และคัดเลือกเฉพาะโคลนที่มีชิ้นดีเอ็นเอที่ใส่ เข้าไปในพาหะ ทำการสกัดพลาสมิดนำมาต่อ เชื่อม (ligation) เข้ากับพลาสมิดพาหะ (expression vector) pET200/D-TOPO (Invitrogen) และส่งถ่ายพลาสมิดสายผสมเข้า E. coli competent cell (Top10) คัดเลือก โคลนที่มีชิ้นดีเอ็นเอสอดแทรกอยู่ transformation เข้า E. coli BL21 (DES 3) เลี้ยงในอาหารเหลว 2XYT ที่มี kanamycin 50 มล./ล. ชักนำให้เกิด การสังเคราะห์โปรตีนด้วย IPTG พบว่าระยะ เวลาที่สามารถสังเคราะห์โปรตีนได้สูงสุด คือ 24 ชม. ให้โปรตีนที่มีขนาดประมาณ 28 กิโลดาล ตัน แยกโปรตีนของเชื้อให้บริสุทธิ์ด้วย Ni-NTA column และนำไปผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดี ในกระต่าย ได้แอนติซีรัมที่สามารถใช้ตรวจสอบ recombinant protein ที่ใช้เป็นแอนติเจนด้วย วิธี Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) พบว่า แอน ติซีรัมจากการฉีดกระตุ้นครั้งที่ 5 ให้ค่าไตเตอร์ สูงสุดที่ 1:204,800 เมื่อทดสอบประสิทธิภาพ ของแอนติซีรัมกับตัวอย่างใบมะเขือเปราะที่ แสดงอาการด่างและใบมะเขือเปราะปกติด้วยวิธี Indirect ELISA และ Nitrocellulose membrane-ELISA (NCM-ELISA) พบว่ามี ความจำเพาะและให้ปฏิกิริยาเป็นบวก และ สามารถใช้ IgG ของ EYMV-CP ตรวจตัวอย่าง มะเขือเปราะที่เป็นโรคได้ตั้งแต่ความเข้มข้น 1:10-1:80