การแสดงออกของโปรตีนไดไฮโดรโฟเลตซินเทส-โฟลีลโพลีกลูตาเมตซินเทสของ Plasmodium falciparum โดยใช้ระบบการแสดงออก pGEX

Abstract

บทคัดย่อ

เอนไซม์ไดไฮโดรโฟเลตซินเทส-โฟลีลโพลีกลูตาเมตซินเทส (dihydrofolate synthase - folylpolygluta-mate synthase) เป็นเอนไซม์ในวิถีโฟเลตซึ่งเป็นวิถีสำคัญในการสังเคราะห์สารพันธุกรรมของมาลาเรีย Plasmodium falciparum และเป็นเอนไซม์สำคัญที่จะนำมาใช้เป็นเป้าหมายในการพัฒนายาต้านมาลาเรีย ดังนั้นการแสดงออกและผลิตเอนไซม์ไดไฮโดรโฟเลตซินเทส-โฟลีลโพลีกลูตาเมตซินเทสของ P. falciparum จึงมีความจำเป็นเพื่อใช้ในการศึกษาและพัฒนายาให้สามารถจับกับเอนไซม์ได้อย่างจำเพาะ งานวิจัยที่ผ่านมาพบว่าสามารถทำให้มีการสร้างเอนไซม์ไดไฮโดรโฟเลตซินเทส-โฟลีลโพลีกลูตาเมตซินเทสของ P. falciparum ในแบคทีเรีย Eschelichia coli ได้ แต่พบปัญหาคือโปรตีนส่วนใหญ่อยู่ในส่วนของโปรตีนที่ไม่ละลายน้ำ ดังนั้นในงานวิจัยนี้ ผู้วิจัยใช้ระบบ pGEXเพื่อทำการแสดงออกเอนไซม์ไดไฮโดรโฟเลตซินเทส-โฟลีลโพลีกลูตาเมต ซินเทสของ P. falciparum เชื่อมต่อกับกลูตาไธโอน เอส-ทรานสเฟอเรส (glutathione S-transferase) ใน E. coli BL21(DE3) โดยกระตุ้นการแสดงออกของโปรตีนด้วยการใช้สูตรอาหารกระตุ้นการแสดงออกอัตโนมัติ ZYM-5052 ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 12 ชั่วโมง และนำไปกระตุ้นต่อที่อุณหภูมิ 18 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ได้โปรตีนไดไฮโดรโฟเลตซินเทส-โฟลีลโพลีกลูตาเมตซินเทสของ P. falciparum เชื่อมต่อกับกลูตาไธโอน เอส-ทรานสเฟอเรสที่มีขนาดประมาณ 87 กิโลดาลตัน ในส่วนละลายน้ำ และสามารถทำให้บริสุทธิ์เบื้องต้นได้ด้วย glutathione sepharose 4 fast flow resin เพื่อนำไปใช้ในการศึกษาพัฒนายาต้านมาลาเรียต่อไปได้

คำสำคัญ : มาลาเรีย; Plasmodium falciparum; ไดไฮโดรโฟเลตซินเทส-โฟลีลโพลีกลูตาเมตซินเทส; การแสดงออกของโปรตีน

Abstract

Dihydrofolate synthase-folylpolyglutamate synthase (DHFS-FPGS) is one of the enzymes in folate biosynthesis pathway, which is important for genetic material synthesis in malarial parasite Plasmodium falciparum. Due to its important function in the pathway, the enzyme is considered to be one of the candidates as new drug targets. Therefore, expression and production of P. falciparum DHFS-FPGS enzyme is crucial for use in specific inhibitor-target binding during the process of drug discovery and development. Previous studies by other research groups showed that P. falciparum DHFS-FPGS could be expressed in Escherichia coli but most of the expressed proteins were in the form of insoluble fraction. In this study, we used pGEX expression system to express Glutathione S-transferase (GST)-fusion DHFS-FPGS protein in E. coli BL21 (DE3). The GST-fusion DHFS-FPGS protein, at the size of approximately 87 kilodaltons, could be induced as a soluble form, using autoexpression system by culturing the bacteria in ZYM-5052 media at 37 °C for 12 hours followed by 18 °C for another 24 hours. When purified using glutathione Sepharose 4 Fast Flow resin, the protein could be further used for antimalarial drug development.

Keywords: Plasmodium falciparum; dihydrofolate synthase-folylpolyglutamate synthase; protein expression