การผลิตรีคอมบิแนนท์เอนไซม์เอนเทอโรไคเนสสายสั้นโดย Pichia pastoris

Abstract

บทคัดย่อ

เอนเทอโรไคเนส (EC 3.4.21.9) เป็นเอนไซม์จำพวกเซอรีนโปรติเอสซึ่งทำหน้าที่ตัดพันธะเปปไทด์ทางด้านปลายคาร์บอกซี่ที่ตำแหน่งตัดจำเพาะ (Asp)₄Lys ของโปรตีน จากสมบัติของเอนไซม์ชนิดนี้ที่มีความจำเพาะและมีความเสถียรสูง รวมถึงความสามารถทำงานได้ในช่วงอุณหภูมิและพีเอชที่กว้าง ทำให้มีการนำเอนไซม์ชนิดนี้มาใช้ในงานทางด้านวิศวกรรมโปรตีน ในงานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อมุ่งเน้นการเพิ่มประสิทธิภาพการผลิตรีคอมบิแนนท์เอนไซม์เอนเทอโรไคเนสสายสั้น (rEK_L) ในรูปที่ผลิตแล้วถูกปลดปล่อยออกนอกเซลล์เจ้าบ้าน โดยใช้เชื้อยีสต์ Pichia pastoris สายพันธุ์ Y11430 (pPICZαB_NH8_EK_L) ที่มียีน EK_L แทรกอยู่ในโครโมโซม ซึ่งผู้วิจัยได้ศึกษาอิทธิพลของพีเอช อุณหภูมิ และอัตราการเติมอาหารเมทานอล ที่มีผลต่อการผลิตเอนไซม์ rEK_L ซึ่งพบว่าสภาวะที่เหมาะสมในการผลิตเอนไซม์ rEK_L คือ พีเอช 6.0 อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส และอัตราการเติมอาหารเมทานอล 16.94 กรัมต่อชั่วโมง โดยหลังจาก 195 ชั่วโมง ของการเพาะเลี้ยง พบว่ามีค่ากิจกรรมของ rEK_L สูงถึง 123.33 หน่วยต่อมิลลิลิตร หรือคิดเป็นค่ากิจกรรมเอนไซม์จำเพาะเท่ากับ 421.23 หน่วยต่อมิลลิกรัมโปรตีน และสามารถตรวจพบแถบโปรตีนซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 41 ถึง 44 กิโลดาลตันที่คาดว่าเป็นเอนไซม์ rEK_L ในน้ำหมัก

คำสำคัญ : เอนเทอโรไคเนส; รีคอมบิแนนท์โปรตีน; ฟิวชันโปรตีน; Pichia pastoris

Abstract

Enterokinase (EC 3.4.21.9) is a serine proteinase that cleaves at the C-terminal of specific sequence (Asp)₄Lys of  protein. Its high specificity of the recognition site and high stability with a wide range of catalytic pH and temperatures make enterokinase with broad utilities in molecular protein engineering. This work aimed to increase the efficiency of recombinant enterokinase light chain (rEK_L ) production in the secretory form by a recombinant strain of the methylotrophic yeast Pichia pastoris Y11430 (pPICZαB_NH8_EKL). The influences of pH, temperature, and methanol medium feed rate in rEK_L production were studied. The results showed that high level of rEK_L production was obtained at pH 6.0 and temperature 30 ºC when 16.94 g/h methanol medium feed rate were applied. After 195 h of the cultivation, 123.33 U/ml rEK_L activity and 421.23 U/mg_protein rEK_L specific activity were achieved. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis resulted in protein bands with molecular weight of 41 to 44 kDa that may represent rEK_L.

Keywords: enterokinase; recombinant protein; fusion protein; Pichia pastoris