การพัฒนาเทคนิค Reverse Transcription-loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) สำหรับการตรวจหาเชื้อก่อโรคโควิด 19
Article Sidebar
Main Article Content
บทคัดย่อ
ไวรัสซาร์สโควี 2 (SARS-CoV-2) ก่อให้เกิดโรคติดเชื้อไวรัสโคโรนา 2019 (COVID-19) ซึ่งเป็นโรคอุบัติใหม่ที่ทำให้มีผู้ติดเชื้อและเสียชีวิตเป็นจำนวนมากทั่วโลก การตรวจหาสารพันธุกรรมโดยเทคนิค real time RT-PCR ในสิ่งส่งตรวจจากระบบทางเดินหายใจ เป็นวิธีมาตรฐานทางห้องปฏิบัติการเพื่อวินิจฉัยโรค ซึ่งต้องใช้เครื่อง thermocycler ที่ซับซ้อนและมีราคาสูง ทำให้เป็นข้อจำกัดในการใช้งานในห้องปฏิบัติการทั่วไป LAMP เป็นเทคนิคการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมที่อุณหภูมิเดียว วิธีการง่าย ใช้ระยะเวลาสั้น และอ่านผลได้ง่ายด้วยตาเปล่า โดยสังเกตจากการเปลี่ยนสีของปฏิกิริยา การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาเทคนิค RT-LAMP สำหรับการตรวจหาไวรัส SARS-CoV-2 โดยออกแบบไพรเมอร์และทดสอบความจำเพาะกับลำดับสารพันธุกรรมของไวรัส รวมทั้งปฏิกิริยาข้ามต่อจุลินทรีย์อื่นในฐานข้อมูล GISAID และ NCBI จากนั้นทดสอบสภาวะที่เหมาะสมของปฏิกิริยา และหาปริมาณขั้นต่ำสุดของไวรัสที่ตรวจพบได้ ผลการศึกษาได้ไพรเมอร์ในตำแหน่ง ORF8 ที่มีความจำเพาะกับลำดับสารพันธุกรรมของไวรัส SARS-CoV-2 ในฐานข้อมูลมากกว่าร้อยละ 98 และเมื่อเปรียบเทียบกับจุลินทรีย์อื่นมีความเหมือนน้อยกว่าร้อยละ 80 สภาวะที่เหมาะสมของปฏิกิริยา คือ 60 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และปริมาณขั้นต่ำสุดของไวรัสที่ตรวจพบได้ คือ 25 copies ต่อปฏิกิริยา ดังนั้นเทคนิค RT-LAMP ที่พัฒนาขึ้นสามารถตรวจหาไวรัส SARS-CoV-2 ซึ่งจะต้องมีการประเมินกับสิ่งส่งตรวจจากผู้ป่วยเพื่อพิจารณาการนำไปใช้ประโยชน์ในการตรวจวินิจฉัยโรคโควิด-19 ต่อไป
Article Details
References
Zhu, N., Zhang, D., Wang, W., Li, X., Yang, B., Song, J., et al., 2020, A novel corona virus from patients with pneumonia in China, 2019, N. Engl. J. Med. 382: 727-733.
Ksiazek, T.G., Erdman, D., Goldsmith, C.S., Zaki, S.R., Peret, T., Emery, S., et al., 2003, A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome, N. Engl. J. Med. 348: 1953-1966.
Lu, R., Zhao, X., Li, J., Niu, P., Yang, B., Wu, H., et al., 2020, Genomic characterization and epidemiology of 2019 novel corona virus: Implications for virus origins and receptor binding, Lancet. 395: 565-574.
Okada, P., Buathong, R., Phuygun, S., Thana dachakul, T., Parnmen, S., Wongboot, W., et al., 2020, Early transmission patterns of coronavirus disease 2019 (COVID-19) in travellers from Wuhan to Thailand, January 2020, Eur. Surveill. 25(8): 2000097.
Department of Disease Control, COVID-19 Infected Situation Reports (Thailand), Available Source: https://covid19.ddc.moph.go.th/en, January 9, 2021.
Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N., et al., 2000, Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Res. 28(12): E63.
Huang, W.E., Lim, B., Hsu, C.C., Xiong, D., Wu, W., Yu, Y., et al., 2020, RT-LAMP for rapid diagnosis of coronavirus SARS-CoV-2, Microb. Biotechnol. 13: 950-961.
Yu, L., Wu, S., Hao, X., Dong, X., Mao, L., Pelechano, V., et al., 2020, Rapid detection of COVID-19 coronavirus using a reverse transcriptional loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) diagnostic platform, Clin. Chem. 66: 975-977.
Chow, F.W., Chan, T.T., Tam, A.R., Zhao, S., Yao, W., Fung, J., et al., 2020, A rapid, simple, inexpensive, and mobile colorimetric assay COVID-19-LAMP for mass on-site screening of COVID-19, Int. J. Mol. Sci. 21: 5380.
Rohaim, M.A., Clayton, E., Sahin, I., Vilela, J., Khalifa, M.E., Al-Natour, M.Q., et al., 2020, Artificial intelligence-assisted loop mediated isothermal amplification (AI-LAMP) for rapid detection of SARS-CoV-2, Viruses 12(9): 972.
Nawattanapaiboon, K., Pasomsub, E., Prombun, P., Wongbunmak, A., Jenjitwanich, A., Mahasupachai, P., et al., 2021, Colorimetric reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) as a visual diagnostic platform for the detection of the emerging coronavirus SARS-CoV-2, Analyst 146: 471-477.
Baek, Y.H., Um, J., Antigua, K.J.C., Park, J.H., Kim, Y., Oh, S., et al., 2020, Development of a reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification as a rapid early-detection method for novel SARS-CoV-2, Emerg. Microbes. Infect. 9: 998-1007.
González-González, E., Lara-Mayorga, I.M., Rodríguez-Sánchez, I.P., Zhang, Y.S., Martínez-Chapa, S.O., Santiago, G.T., et al., 2021. Colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for cost-effective and quantitative detection of SARS-CoV-2: The change in color in LAMP-based assays quantitatively correlates with viral copy number, Anal Methods 13: 169-178.
Fang S., Li, K., Shen, J., Liu, S., Liu, J., Yang, L., et al., 2021. GESS: A database of global evaluation of SARS-CoV-2/hCoV-19 sequences, Nucleic Acids Res., 49(D1): D706-D14.
National Center for Biotechnology Information, GenBank, Available Source: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, January 9, 2021.
U.S. Food and Drug Administration, Molecular Diagnostic Template for Laboratories, Available Source: https://w ww.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-au thorizations-medical-devices/vitro-diagno stics-euas, January 9, 2021.
Color Genomics, Inc., Color SARS-CoV-2 RT-LAMP Diagnostic Assay for Emergency Use Only (IFU), Available Source: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas, January 9, 2021.
Centers for Disease Control and Prevention, CDC 2019-novel Coronavirus (2019-nCoV) Real Time RT-PCR Diagnostic Panel for Emergency Use Only (IFU), Avail able Source: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/vitro-diagnostics-euas, January 9, 2021.
Akkapaiboon, P.A., Warawan, W., Thanada chakul, T, Puygun, S., Kala, S., Meechalard, W., Waichroen, S., Chittaganpitch, M. and Uppapong, B., 2020, Development of DMSc COVID-19 Real Time RT-PCR Reagent Kits, Bull. Dept. Med. Sci. 62(3): 143-154 (in Thai)
Ceraolo, C., Giorgi, F.M., 2020, Genomic variance of the 2019-nCoV coronavirus, J. Med. Virol. 92: 522-528.
Kakhki, R.K., Kakhki, M.K., Neshan,i A., 2020, COVID-19 target: A specific target for novel coronavirus detection, Gene Rep. 20: 100740.
Alouane, T., Laamarti, M., Essabbar, A., Hakmi, M., Bouricha, E.M., Chemao-Elfihri, M.W., et al., 2020, Genomic diversity and hotspot mutations in 30,983 SARS-CoV-2 genomes: Moving toward a universal vaccine for the "confined virus"?, Pathogens 9(10): 829.
Gong, Y.N., Tsao, KC., Hsiao, M.J., Huang, C.G., Huang, P.N., Huang, P.W., et al., 2020, SARS-CoV-2 genomic surveillance in Taiwan revealed novel ORF8-deletion mutant and clade possibly associated with infections in Middle East, Emerg. Microbes Infect. 9: 1457-166.
Yan, Y., Chang, L. and Wang, L., 2020, Laboratory testing of SARS-CoV, MERS-CoV, and SARS-CoV-2 (2019-nCoV): Current status, challenges, and counter measures, Rev. Med. Virol. 30(3): e2106.
Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H. and Notomi, T., 2008, Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products, Nat. Protoc. 3: 877-882.
Tanne, N.A., Zhang., Y., Evans, T.C.Jr., 2015, Visual detection of isothermal nucleic acid amplification using pH-sensitive dyes, Biotechniques 58: 59-68.
Wang, W., Xu, Y., Gao, R., Lu, R., Han, K., Wu, G., et al., 2020, Detection of SARS-CoV-2 in different types of clinical specimens, JAMA 323: 1843-1844.
Kleiboeker, S., Cowden, S., Grantham, J., Nutt, J., Tyler, A., Berg, A., et al., 2020, SARS-CoV-2 viral load assessment in respiratory samples, J. Clin. Virol. 129: 104439.