ความเสถียรของ Infectious Clone เชื้อไวรัสใบด่างจุดวงแหวนมะละกอ (PRSV–P) ในพลาสมิดพาหะ

บทคัดย่อ

นำโคลนของพลาสมิด pCF17_7 และ pCF17_8 ซึ่งเป็น infectious clone ของเชื้อไวรัสใบด่างจุดวงแหวนชนิดพี (Papaya ringspot virus type P; PRSV–P) ประกอบด้วย cDNA เต็มสายของจีโนมเชื้อ PRSV–SMK5 ที่มีความยาวของอาร์เอ็นเอจีโนม 10,323 นิวคลีโอไทด์ (nts) และมีนิวคลีโอไทด์ที่ไม่ใช่ของไวรัส 10 nts และ 14 nts ที่ปลาย 5´ และปลาย 3´ ตามลำดับ และตามด้วยปลาย 3´poly(A) จำนวน 35 nts ที่ถ่ายพลาสมิดเข้าสู่แบคทีเรีย Escherichia coli DH5–α มาวิเคราะห์ความเสถียรของพลาสมิด โดยโคลน cDNA สายเต็มของ PRSV–SMK5 สร้างขึ้นด้วยการโคลนนิ่งแบบต่อเนื่องเป็นลำดับและเทคนิค overlap extension PCR cloning ควบคุมด้วยชุดโปรโมเตอร์ Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S จำนวนสองชุดต่อเนื่องกัน และหยุดการถอดรหัสด้วย CaMV 35S terminator ในพลาสมิดเวคเตอร์ pCass2 พบว่าพลาสมิด pCF17_7 และ pCF17_8 และ พลาสมิดโครงสร้าง pCass2 ยังคงความเสถียร เมื่อผ่านการเพาะเลี้ยงเชื้อแบบย้ายเชื้อต่อเนื่องกันสิบรอบ (passage) โดยสุ่มเลือกสิบโคโลนีมาเลี้ยงในอาหารคัดเลือก LB ที่เติม Ampicillin 100 ppm เขย่านานรอบละ 24 ชั่วโมง จากนั้นนำอาหารเลี้ยงเชื้อที่ได้มาเจือจางเพื่อเลี้ยงต่อในรอบถัดไปจนครบสิบรอบ เมื่อสกัดพลาสมิดที่ได้หลังจากเลี้ยงครบในแต่ละรอบด้วยวิธี alkaline lysis และตรวจวิเคราะห์ขนาดพลาสมิดด้วยเทคนิค agarose gel electrophoresis พลาสมิด pCF17_7 และ pCF17_8 ยงั คงเกดิ โรคไดกั้บมะละกอที่ทดสอบ