การสังเคราะห์ in vivo Transcript จากโคลน cDNA เต็มสายของเชื้อไวรัสใบด่างจุดวงแหวนมะละกอ (PRSV-P) สายพันธุ์ไทย

บทคัดย่อ

โคลนจีโนมเต็มสายของเชื้อไวรัสใบด่างจุดวงแหวนมะละกอ (Papaya Ringspot Virus (PRSV-P) สายพันธุ์ไทย โดยการสังเคราะห์ cDNA ของเชื้อไวรัส PRSV–SMK5 ด้วยปฏิกิริยา reverse transcription–polymerase chain reaction (RT-PCR) ของจีโนมเป็นส่วน ๆ จำนวน 7 ชิ้นย่อย มีความยาวตั้งแต่ 493 ถึง 2,706 นิวคลีโอไทด์ (nts) โดยกำหนดให้แต่ละชิ้นซ้อนเหลื่อมกันทั้งจีโนม ด้วยการใช้ไพรเมอร์ที่ออกแบบจากตำแหน่งของเอนไซม์ตัดจำเพาะที่มีเพียงหนึ่งตำแหน่งบนจีโนม นำแต่ละชิ้นย่อยโคลนเข้าพลาสมิด pGEM^®–T easy เพื่อตรวจสอบลำดับนิวคลีโอไทด์ และเป็นแหล่งสังเคราะห์ดีเอ็นเอเพื่อโคลนเข้าพลาสมิด pCass2 ซึ่งมีการขับเคลื่อนการถอดรหัสของยีน (transcription) ด้วยชุดโปรโมเตอร์ Cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S จำนวนสองชุดต่อเนื่องกัน และหยุดการถอดรหัสด้วย CaMV 35S terminator โดยการโคลนนิ่งแบบต่อเนื่องเป็นลำดับ ด้วยเทคนิค overlap extension PCR cloning ได้โคลน cDNA เต็มสายของจีโนมเชื้อ PRSV–SMK5 จำนวนสองพลาสมิดให้ชื่อว่า pCF17_7 และ pCF17_8 ที่มีความยาวของจีโนม ซึ่งรวม 35 nts ของส่วน poly(A) ยาว 10,358 nts เท่ากัน ประกอบด้วยส่วนไม่ถอดรหัสที่ปลาย 5´ จำนวน 85 nts และที่ปลาย 3´ จำนวน 206 nts มีลำดับ นิวคลีโอไทด์ 10,032 nts ที่ถอดรหัสได้เป็น polyprotein ประกอบด้วย 3,343 กรดอะมิโนพลาสมิดทั้งสองโคลนทำให้มะละกอเกิดอาการโรคใบด่างจุดวงแหวนมะละกอ หลังการปลูกเชื้อด้วยพลาสมิดเป็นเวลา 21 วัน ตรวจยืนยันพบสารพันธุกรรมอาร์เอ็นเอของเชื้อไวรัสด้วยเทคนิค RT–PCR และโปรตีนห่อหุ้มของเชื้อ PRSV ด้วยเทคนิค ELISA และตรวจพบอนุภาคของเชื้อ PRSV ด้วยเทคนิค immune electron microscopy