การใช้เทคนิค duplex RT-PCR สำหรับตรวจสอบเชื้อ Piper yellow mottle virus และ Cucumber mosaic virus ที่ก่อโรคในพริกไทย

บทคัดย่อ

Piper yellow mottle virus (PYMoV) และ Cucumber mosaic virus subgroup I (CMV subgroup I) เป็นเชื้อไวรัสที่สำคัญและสร้างความเสียหายให้กับผลผลิตพริกไทยตามแหล่งปลูกต่าง ๆ ทั่วโลก งานวิจัยครั้งนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อใช้เทคนิค duplex reverse transcription-PCR (duplex RT-PCR) ในการตรวจสอบเชื้อ PYMoV และ CMV subgroup I จากตัวอย่างพริกไทย โดยคู่ไพรเมอร์ที่จำเพาะต่อเชื้อ PYMoV (PYMoV-F และ PYMoV-R) และ CMV subgroup I (CMV I-F และ CMV I-R) ออกแบบมาจากยีนในส่วน Open reading frame I (ORFI) ของเชื้อ PYMoV และ ยีนในส่วนโปรตีนห่อหุ้มอนุภาค (CP gene) ของเชื้อ CMV subgroup I ซึ่งให้ผลผลิต DNA ขนาดประมาณ 450 และ 500 คู่เบส ตามลำดับ การหาสภาวะที่เหมาะสมต่อการเพิ่มปริมาณเชื้อ PYMoV และเชื้อ CMV subgroup I ด้วยเทคนิค duplex RT-PCR พบว่าความเข้มข้นของ total DNA ของเชื้อ PYMoV ที่เหมาะสมคือ 10, 50 และ 100 นาโนกรัม ในขณะที่ความเข้มข้นของ total RNA ของเชื้อ CMV subgroup I ที่เหมาะสม คือ 100 นาโนกรัม และ 200 นาโนกรัม annealing temperature ที่เหมาะสมคือ 55.8 องศาเซลเซียส และอัตราส่วนของคู่ไพรเมอร์ (PYMoV-F และ PMMoV-R : CMV I-F และ CMV I-R) คือ 1 : 1 การทดสอบประสิทธิภาพของเทคนิค duplex RT-PCR ที่พัฒนาได้โดยตรวจสอบตัวอย่างใบพริกไทยที่แสดงอาการของโรคคล้ายติดเชื้อไวรัส จำนวนทั้งสิ้น 9 ตัวอย่าง ผลที่ได้พบว่าทุกตัวอย่างให้แถบ DNA ขนาดประมาณ 450 คู่เบส เพียงแถบเดียว แสดงว่าติดเชื้อ PYMoV สอดคล้องกับผลการตรวจสอบตัวอย่างด้วยเทคนิค Polymerase chain reaction (PCR) และ Reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RT-PCR) ตามลำดับ ดังนั้นเทคนิค duplex RT-PCR ที่พัฒนาได้ สามารถใช้ตรวจสอบเชื้อ ไวรัสทั้ง 2 ชนิด นี้ ในพริกไทย และในอนาคตสามารถนำไปประยุกต์ใช้ในการคัดเลือกท่อนพันธุ์พริกไทยปลอดเชื้อไวรัสได้