การพัฒนาเทคนิคมัลติเพล็กซ์เรียลไทม์พีซีอาร์ที่มีความแม่นยำสูงสำหรับประเมินสัดส่วนเพศของอสุจิในน้ำเชื้อพ่อโคนม

บทคัดย่อ

การประเมินสัดส่วนเพศของอสุจิด้วยเทคนิคพีซีอาร์เป็นวิธีที่นิยมใช้อย่างกว้างขวางในการประเมินความบริสุทธิ์ของสัดส่วนอสุจิ X และอสุจิ Y ในน้ำเชื้อพ่อโคที่ผ่านกระบวนการคัดแยกเพศ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีการประมาณอัตราส่วนเพศของอสุจิ โดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบมัลติเพล็กซ์เรียลไทม์ (multiplex real - time PCR) ทำการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายที่สนใจพร้อมกันในหลอดเดียวด้วยชุดไพรเมอร์ที่จำเพาะเจาะจงต่อยีน proteolipid protein (PLP) บนโครโมโซม X และไพรเมอร์ที่จำเพาะเจาะจงต่อยีน sex - determining region Y (SRY) บนโครโมโซม Y แสดงการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอผลลัพธ์เส้นใหม่ด้วยสีฟลูออเรสเซนต์ติดที่โพรบ (Taqman) โดยโพรบของยีน PLP ติดสี HEX และโพรบของยีน SRY ติดสี FAM และใช้ดีเอ็นเออ้างอิงจากเซลล์เม็ดเลือดขาวโคเพศผู้ ซึ่งมีอัตราส่วนของโครโมโซม X และโครโมโซม Y ที่เท่ากัน สร้างเป็นกราฟเส้นตรงมาตรฐาน จากการศึกษาได้กราฟเส้นตรงมาตรฐานของยีน PLP และ ยีน SRY แสดงสมการเชิงเส้นสองสมการสำหรับคำนวณอัตราส่วนอสุจิ X และอสุจิ Y โดยมีค่าความชันเฉลี่ยของกราฟเส้นตรงทั้งสองเท่ากับ - 3.330 แสดงถึงปฏิกิริยาที่มีประสิทธิภาพสูงในการสร้างดีเอ็นเอเส้นใหม่ (ร้อยละ 99.66) ทดสอบความแม่นยำของการประเมินสัดส่วนเพศอสุจิด้วยเทคนิค multiplex real - time PCR ในตัวอย่างน้ำเชื้อพ่อโคนมจำนวน 9 ตัวอย่าง ได้แก่ น้ำเชื้อคัดเพศผู้มีอสุจิ Y ร้อยละ 90 ตัวอย่างน้ำเชื้อที่มีอสุจิ Y สัดส่วนร้อยละ 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 และตัวอย่างน้ำเชื้อคัดเพศเมียมีอสุจิ Y ร้อยละ 10 ตามลำดับ เปรียบเทียบผลการคำนวณสัดส่วนอสุจิด้วยเทคนิคมาตรฐานสองเทคนิคคือ  ซิงเกิลเพล็กซ์เรียลไทม์พีซีอาร์แบบแยกหลอด (singleplex real - time PCR) และเทคนิคมัลติเพล็กซ์ดรอปเล็ตดิจิทัลพีซีอาร์ (multiplex droplet digital PCR) ซึ่งแต่ละตัวอย่างถูกทดสอบจำนวนสามซ้ำ แสดงผลการคำนวณเป็นร้อยละของอสุจิ Y จากการเปรียบเทียบผลการประมาณอัตราส่วนเพศอสุจิ พบว่า ทั้งสามเทคนิคสามารถคำนวณสัดส่วนเพศได้ถูกต้องใกล้เคียงกับตัวอย่างที่ทราบค่าที่เตรียมไว้และได้ผลการคำนวณสัดส่วนของอสุจิ Y ใกล้เคียงกันทั้งหมด โดยไม่มีความแตกต่างทางสถิติ ดังนั้น เทคนิค multiplex real - time PCR ที่ได้พัฒนาขึ้นในการศึกษานี้จึงคุ้มค่า ประหยัดเวลา และให้ผลการประเมินสัดส่วนเพศที่แม่นยำ