Detection of genetically modified soybeans by Tetraplex Real-time PCR for agricultural import authorization
Article Sidebar
Main Article Content
Abstract
Soybean is an important raw material for the manufacturing industry, but Thailand cannot produce enough and must imported genetically modified (GM) soybeans for domestic consumption. This authorizes the importation of only approved GM events. However, the general laboratories detect the screening gene by Simplex Real-time PCR which cannot identify multiple GM soybean events at once, takes a long time for testing, wasted chemicals and scientific materials. Therefore, this research aims to develop using Tetraplex Real-time PCR assay to identify GM soybeans approved events namely Mon87701, A2704-12, GTS 40-3-2, Mon87705, Mon87769, and Mon89788. The methods are the following: designed, specificity tested, and studied the optimum concentration of the primer-probe. Then, the limit of detection (LOD), DNA amplification range, and analysis in various samples was tested. The results found that the screening and specific genes were efficiently identified the 6 events of GM soybeans with two sets of primer-probes by Tetraplex Real-time PCR: 1) CaMV35S Promoter, Nos terminator, Cy1Ac, and Lectin 2) rbcS E9 terminator, event Mon87705, event Mon89788, and Lectin. The primer-probe sets are specific, and the suitable concentration was 1X level. The LOD was determined to be 0.1%, the range of DNA amplification was 100–150 ng/reaction, and all other test results were within the basic range values. When expanding the assay to analyze the samples, it is shown that the test results are 100% accurate. It also reduces the cost and time required to support the detection of imported GM plants.
Article Details
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
References
เกศสุนี ชมชื่น, ดวงจันทร์ บุตราศรี และมลิวรรณ นาคขุนทด. 2553. การตรวจสอบจีเอ็มโอในผลิตภัณฑ์อาหารจากถั่วเหลืองและข้าวโพดในจังหวัดพิษณุโลก. NU Science Journal. 7: 38–49.
คณะกรรมการเทคนิคด้านความปลอดภัยทางชีวภาพ. 2560. สถานภาพการพิจารณาผลการประเมินความปลอดภัยทางชีวภาพของอาหารที่ได้จากเทคโนโลยีชีวภาพสมัยใหม่. ใน: รายงานการประชุมคณะกรรมการเทคนิคด้านความปลอดภัยทางชีวภาพ ครั้งที่ 1/2560. 9 มีนาคม 2560. ศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ, ปทุมธานี.
ปิยนุช ศรชัย, ณัฐวดี บุญทองดี, ฐิติรัตน์ อัศวมงคลศิริ, ปริญดา สองเมืองสุข, วีระศักดิ์ พิทักษ์ศฤงคาร และปิยรัตน์ ธรรมกิจวัฒน์. 2563. การพัฒนาวิธีการตรวจคัดกรอง CaMV35S promoter Nos terminator ยีน NptII ร่วมกับยีนอ้างอิงมะละกอในมะละกอดัดแปลงพันธุกรรมด้วยเทคนิค Tetraplex Real-time PCR. น. 85 – 96. ใน: การประชุมวิชาการระดับชาติ มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกำแพงแสน ครั้งที่ 17 เรื่องเกษตรกำแพงแสน ตามรอยพ่อ สานต่อศาสตร์แผ่นดิน
-3 ธันวาคม 2563. มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ วิทยาเขตกำแพงแสน, นครปฐม.
ปิยนุช ศรชัย, ธีระ ชูแก้ว, ณัฐวดี บุญทองดี, ฐิติรัตน์ อัศวมงคลศิริ และขนิษฐา วงศ์วัฒนารัตน์. 2562. การตรวจสอบความใช้ได้ของการตรวจจำแนกยีน Event Specific Mon810 และ NK603 และยีนอ้างอิงพืชด้วยเทคนิค Multiplex Real-time PCR. วารสารวิชาการเกษตร. 3: 224–237.
ปิยรัตน์ ธรรมกิจวัฒน์, ปิยนุช ศรชัย, ฐิติรัตน์ อัศวมงคลศิริ และพงศกร สรรค์วิทยากุล. 2561a. การพัฒนาเทคนิค Triplex Real-Time PCR เพื่อตรวจคัดกรองข้าวโพดดัดแปลงพันธุกรรมตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025. วารสารวิชาการเกษตร. 36: 316-331.
ปิยรัตน์ ธรรมกิจวัฒน์, ปิยนุช ศรชัย, ฐิติรัตน์ อัศวมงคลศิริ, วีระศักดิ์ พิทักษ์ศฤงคาร, พงศกร สรรค์วิทยากุล, บาญเย็น ชาระวงศ์,
และสุธานันทน์ นาคประนม. 2561b. การพัฒนาวิธีตรวจวิเคราะห์พืชและสินค้าพืชดัดแปลงพันธุกรรมตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025 เพื่อการบริการอย่างมีประสิทธิภาพ. น. 196 – 210. ใน: ผลงานดีเด่น กรมวิชาการเกษตร ประจำปี 2561 27 พฤษภาคม 2562. รามาการ์เด้นท์, กรุงเทพมหานคร.
สำนักงานพัฒนาการวิจัยการเกษตร (องค์การมหาชน). 2559. ข้าวโพดเลี้ยงสัตว์ ถั่วเหลือง ถั่วเขียว และถั่วลิสง ทิศทางพืชเศรษฐกิจไทยในอาเซียน. พรทรัพย์การพิมพ์ จำกัด. กรุงเทพฯ.
อโณทัย โภคาธิกรณ์. 2549. Basic Real-time PCR. ใน: การประชุมเชิงปฏิบัติการเรื่อง Introduction to Real time-PCR and its applications. 16-17 พฤศจิกายน 2549. คณะแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยสงขลานครินทร์, สงขลา.
Bahrdt, C., A.B. Krech, A. Wurz, and D. Wulff. 2010. Validation of a newly developed hexaplex real-time PCR assay for screening for presence of GMOs in food, feed and seed. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396: 2103–2112.
Bak, A., and J.B. Emerson. 2019. Multiplex quantitative PCR for single-reaction genetically modified (GM) plant detection and identification of false-positive GM plants linked to Cauliflower mosaic virus (CaMV) infection. BMC Biotechnology. 73: 1-12.
Bustin, SA., V. Benes, JA. Garson, J. Hellemans, J. Huggett, M. Kubista, R. Mueller, T. Nolan, MW. Pfaffl, GL. Shipley,
J. Vandesompele, and CT. Wittwer. 2009. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55: 611–622.
Cardarelli, P., M.R. Branquinho, T.B.F. Renata, P.C. Fernanda, and L.G. Andre. 2005. Detection of GMO in food products in Brazil: the INCQS experience. Food Control. 16: 859-866.
Charles Delobel, C., A. Bogni, G. Pinski, M. Mazzara, and G. Van den Eede. 2013. Event-specific method for the quantification of soybean line MON89788 using Real-time PCR v 1.01 - Validation report and validated method. EUR 26153 EN. Publications Office of the European Union, Luxembourg.
Debode, F., I. Huber, R. Macarthur, PE. Rischitor, M. Mazzara, V. Herau, D. Sebah, D. Dobnik, S. Broeders, NH. Roosens, U. Busch, G. Berben, D. Morisset, and J. Zel. 2016. Inter-laboratory studies for the validation of two singleplex (tE9 and pea lectin) and one duplex (pat/bar) real-time PCR methods for GMO detection. Food Control. 73: 452-461.
Eugster, A., P. Murmann, A. Kaenzig, and A. Breitenmoser. 2014. Development and validation of a P-35S, T-nos,
T-35S and P-FMV Tetraplex Real-time PCR screening method to detect regulatory genes of genetically modified organisms in food. Food Analysis. 68: 701–704.
European Network of GMO Laboratories (ENGL). 2015. Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing. European Commission Joint Research Centre, Ispra (VA), Italy.
Fraga, D., T. Meulia, and S. Fenster. 2014. Real-Time PCR. Current protocols essential laboratory techniques. Available: https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/9780470089941.et1003s08. Accessed Sep. 2, 2021.
Grohmann, L., R. Reiting, D. Maede, S. Uhlig, K. Simon, K. Frost, G. Jit Randhawa, and K. Zur. 2015. Collaborative trial validation of cry1Ab/Ac and Pubi-cry TagMan-based real-time PCR assays for detection of DNA derived from genetically modified Bt plant products. Accreditation and Quality Assurance. 20: 85-96.
Grohmann, Lutz., A. Belter, B. Speck, O. Goerlich, P. Guertler, A. Angers-Loustau, and A. Patak. 2017. Screening for six genetically modified soybean lines by an event-specific multiplex PCR method: Collaborative trial validation of a novel approach for GMO detection. Journal of Consumer Protection and Food Safety. Available: https://link.springer.com/article/10.1007/s00003-016-1056-y. Accessed Aug. 6, 2021.
Hougs, L., F. Gatto, O. Goerlich, L. Grohmann, K. Lieske, M. Mazzara, F. Narendja, J. Ovesná, N. Papazova, I. Scholtens, and J. Žel. 2017. Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods (Version 2). EUR 29015 EN. Publications Office of the European Union, Luxembourg.
Huang, H.Y., and T.M. Pan. 2004. Detection of genetically modified Maize Mon810 and NK603 by Multiplex and Real-Time polymerase chain reaction methods. Journal of Agricultural and Food Chemistry.52: 3264–3268.
Koppel, R., F. Velsen, N. Felderer, and T. Bucher. 2012. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from four transgenic soy Mon89788, A5547-127, Roundup Ready, A2704-12 and lectin. Eur Food Res Technol. Available: https://www.researchgate.net/publication/257372901. Accessed Aug. 6, 2021.
Life technologies. 2012. Real-time PCR handbook. Available: https://www.gene-quantification.de/real-time-pcr-handbook-life-technologies-update-flr.pdf. Accessed Sep. 2, 2021.
Lu, J., G.Z. Ji, G. Li, Y.F. Wu, J. Yang, S.L. Lin, D.L. Yang, J.N. Zhao, and W.M. Xiu. 2016. Development of a multiplex event-specific PCR assay for detection of genetically modified rice. Cereal Research Communications. 44: 47–56.
Lucena-Aguilar, G., M.S-L. Ana, B-A. Cristina, A.C. Jose´, A.L-G. Jose,´and A-Q. Rocio. 2016. DNA source selection for downstream applications based on DNA quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14: 264-270.
Pauli, U., M. Liniger, and M. Schrott. 2001. Quantitative detection of genetically modified soybean and maize: method evaluation in a swiss ring trial. Mitteilungen aus Lebensmitteluntersuchung und Hygiene. 92: 145-158.
Pitaksaringkarn, W., T. Assawamongkholsiri, P. Sornchai, and P. Thammakijjawat. 2021. Development of the In-House genetically modified wheat Mon71800 reference plasmid for qualitative detection by Tetraplex Real-Time PCR. pp. 512 - 519. In Proceedings of RSU International Research Conference 30 April 2021. Pathum Thani, Thailand.
Rogers, S.O., and A.J. Bendich. 1985. Extraction of DNA from milligram amounts of fresh herbarium and mummified plant tissues. Plant Molecular Biology. 5: 69-76.
Royal Botanic Garden, B.G. 2012. Kew. Plant DNA c-values database. Available: http://data.kew.org/cvalues/. Accessed Aug. 11, 2020.
Savini, C., M. Mazzara, C. Charles Delobel, G. Pinski, and G. Van den Eede. 2012. Event-specific method for the quantification of soybean MON87705 using Real-time PCR. Validation report and validated method. EUR 25499 EN. Publications Office of the European Union, Luxembourg.
Sigma-Aldrich. 2014. Primers and fluorescent probes for quantitative Real-time PCR and other applications. World Headquarters St. Louis, Missouri, US.
Waiblinger, H.U., B. Ernst, A. Anderson, and K. Pietsch. 2008. Validation and collaborative study of a P35S and T nos duplex Real-time PCR screening method to detect genetically modified organism in food product. European Food Research and Technology. 226: 1221-1228.
